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APLICACIÓN CLÍNICA ACTUAL DE LOS FACTORES DE CRECIMIENTO EN CIRUGÍA ORTOPÉDICA Y TRAUMATOLOGÍA

M Sanchez*, E Anitua**, I Andía***

* Unidad de Cirugía Artroscópica, Clínica La Esperanza-USP. Vitoria.
** BTI, Biotechnology Institute. San Antonio 15. Vitoria.
*** Departamento de Investigación Neuroquímica. Osakidetza, Servicio Vasco de Salud.

Correspondencia:
Dr. Mikel Sanchez
Clínica La Esperanza-USP
C/ La Esperanza, 3
01002 Vitoria


Resumen

Con el fin de facilitar información esencial, que fundamenta el papel de los factores de crecimiento en los mecanismos biológicos de reparación, se describe brevemente la respuesta tisular básica a la lesión. Se reconocen tres fases ó etapas consecutivas, que se superponen: etapa inflamatoria, de proliferación y reparación y una última fase de remodelado. Numerosos estudios experimentales describen la participación de los factores de crecimiento en estos mecanismos y avalan los principios básicos para su utilización terapéutica. Se describen los protocolos para la aplicación práctica de plasma rico en factores de crecimiento (PRGF), asociada a la cirugía ó como tratamiento de lesiones tendinosas y musculares.
Se prepara un plasma rico en factores de crecimiento (PRGF) a partir de la sangre del paciente, minutos antes de realizar la intervención. Este plasma incluye un número elevado de plaquetas, que contienen factores de crecimiento y otras proteínas. Mediante la adición de cloruro de calcio se provoca la activación del plasma y el vaciado de los gránulos alfa; de esta forma, se consigue aplicar factores de crecimiento en el mismo lugar de la lesión. Los factores de crecimiento contenidos en esta preparación inciden especialmente en las etapas iniciales de inflamación y proliferación, reduciendo la intensidad de la inflamación y acortando la duración de ambas etapas. El resultado final es una aceleración significativa de la recuperación funcional. La preparación y utilización correcta de los factores de crecimiento junto con la fibrina, contenidos en el PRGF, reporta beneficios clínicos considerables.

Palabras clave
Plasma rico en factores de crecimiento (PRGF), reparación tisular, lesiones tendinosas, lesiones musculares.

Introducción.

Las aportaciones recientes de la investigación básica han ampliado la información de los procesos celulares y moleculares implicados en la reparación y regeneración de tejidos en general, y en particular de los tejidos del aparato locomotor. Estos conocimientos han permitido el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas, entre ellas la utilización de factores de crecimiento (FCs), que es el objeto de nuestros trabajos, iniciados hace años en el campo de la cirugía oral (1,2,3)
Los factores de crecimiento (FCs) son proteínas con un efecto reconocido en la formación de tejido nuevo (4) En este sentido es evidente que los FCs liberados tras la desgranulación de las plaquetas en el lugar de la lesión proporcionan las señales iniciales para la activación de las células integrantes de los tejidos que rodean la lesión (5) Como respuesta a las señales que proporcionan estas moléculas, las células locales y las infiltradas sufren cambios en la proliferación, diferenciación y síntesis de proteínas con distintas funciones biológicas. Todos estos fenómenos, en conjunto, definen el proceso que se conoce como activación celular.
La utilización de una fracción plasmática autóloga, rica en factores de crecimiento, para suministrar FCs de manera eficaz, y acelerar la regeneración de tejido óseo y de los tejidos blandos adyacentes ha proporcionado muy buenos resultados clínicos en cirugía oral y maxilofacial (6,7) Basándonos en estos resultados y en el hecho de que los FCs son responsables de la activación celular en cualquier sistema u órgano (8), se ha desarrollado su aplicación en los diferentes tejidos del sistema músculo-esquelético (9, 10).

Mecanismos biológicos que participan en la reparación de tejidos.
Una revisión de la secuencia de mecanismos biológicos que tienen lugar durante la reparación facilita la compresión del papel que desempeñan los FCs, en los citados mecanismos y los principios básicos de su utilización, así como la comprensión del potencial clínico del plasma rico en factores de crecimiento (PRGF)
En términos generales, en la reparación de tejidos se reconocen tres fases consecutivas que se solapan entre sí: una fase inflamatoria aguda, una segunda fase de proliferación y reparación y una tercera fase de remodelado (11)
Desde una perspectiva molecular la respuesta de los tejidos a una lesión se caracteriza por un perfil determinado de secreción y actividad de los FCs que va variando a medida que evolucionan las fases de reparación. La liberación de dichos FCs, en respuesta a la lesión, está coordinada con un aumento en la expresión de receptores específicos para estos FCs.
En la fase aguda tras la lesión, los daños ocasionados en las membranas celulares, originan cambios en la permeabilidad vascular y como consecuencia trasvase de fluido, vasoconstricción reactiva, isquemia y cambios metabólicos. Clínicamente esta inflamación se manifiesta asociada a eritema, dolor y pérdida de función. En todo este proceso intervienen cambios vasculares, celulares y químicos, que van evolucionando en el transcurso de las distintas fases. En el mejor de los casos conducen a la reparación del tejido y, en casos desfavorables, a la degeneración crónica, al tejido cicatricial y a la formación de fibrosis y adherencias.
La fase inflamatoria se caracteriza por un aumento de la vasodilatación, inducida por el óxido nítrico (NO), y un incremento del flujo sanguíneo que facilita el movimiento secuencial de las distintas poblaciones celulares hacia el lugar de la herida. Los neutrófilos seguidos de monocitos y macrófagos, limpian la zona fagocitando los restos celulares del tejido dañado. Las señales moleculares iniciales suministradas por el coagulo sanguíneo que se forma tras la lesión vascular, son amplificadas por los macrófagos (12)
Este conjunto de proteínas señala el inicio de una segunda fase de proliferación y reparación (11) Los cambios característicos de esta fase son la formación del coágulo de fibrina, la migración celular de fibroblastos y células progenitoras que proliferan y sintetizan proteínas de la matriz extracelular, principalmente colágeno; existe una población de células locales que también proliferan en respuesta a estas señales proteicas.
Al final de la fase de proliferación, el coágulo provisional de fibrina se sustituye gradualmente, por otra estructura más permanente, formada por colágeno. Esta estructura se denomina tejido de granulación, invade el espacio de la lesión, y sería la característica de esta etapa. Paralelamente ha tenido lugar la angiogénesis: migración y proliferación de células endoteliales que invaden la estructura de fibrina y utilizan primero la fibrina y a continuación el tejido de granulación, como soporte.
En la fase final de remodelado, este tejido se reestructura y se sustituye por un tejido mejor organizado, cuyas fibras de colágeno se han orientado, y se caracteriza por un menor contenido celular y vascular y una matriz extracelular más densa.
En los protocolos de aplicación del PRGF en vez del coágulo sanguíneo que se forma tras la rotura de vasos en la fase inicial, y que está constituida por plaquetas, hematíes y leucocitos, se ocupa la zona de la lesión con un coágulo blanco, formado por una red de fibrina que contiene un número elevado de plaquetas. Este hecho cambia el entorno bioquímico de la lesión influyendo en la evolución clínica: se observa una disminución significativa de la inflamación así como una aceleración de la fase de proliferación y de reparación.

Factores de crecimiento contenidos en el PRGF y su papel en la reparación.
Existe la posibilidad de incidir en estos mecanismos, favoreciendo y acelerando el proceso global de reparación mediante el suministro de PRGF, plasma rico en factores de crecimiento, en el lugar de la lesión. Para comprender mejor el potencial clínico del PRGF es necesario tener algunas nociones de las características biológicas de estos FCs y de su mecanismo de acción. Los FCs contenidos en esta preparación actúan de forma autocrina y/ó paracrina; afectan al comportamiento celular uniéndose a receptores específicos situados en la membrana de las células (13) No todos los fenotipos celulares tienen los mismos receptores, por tanto el efecto del PRGF no será idéntico en todos los tejidos ni en todas las situaciones. También existen otras circunstancias que afectan a la biodisponibilidad de los FCs, en la preparación. Por ejemplo, una gran parte del TGF-beta y del IGF-I se encuentran en forma latente, esto es unido a otra proteína que los inactiva. Dependiendo de variables bioquímicas del entorno biológico, como el pH, dichas proteínas se activan, y están disponibles para interaccionar con sus receptores (14) Como consecuencia de esta interacción se desencadena una cascada compleja de señales intracelulares, cuyo destino final es el núcleo de la célula, donde tiene lugar la activación de un gen específico. La consecuencia de esta activación es la transcripción de ARNm y finalmente la síntesis de una proteína concreta.
Los factores de crecimiento que forman parte del PRGF y que participan activamente en la reparación y regeneración son: PDGF (factor de crecimiento derivado de las plaquetas), TGF-beta-1 y beta-2 (factor de crecimiento transformante beta-1 y beta-2), IGF-I (factor de crecimiento insulínico tipo I), VEGF (factor de crecimiento vascular endotelial A y C), bFGF (factor de crecimiento fibroblástico básico ó FGF-2), EGF (factor de crecimiento epidérmico) y HGF (factor de crecimiento hepatocítico)
Sus nombres derivan de la actividad biológica por la que se identificaron inicialmente ó bien de las células que las suministraban (ej: plaquetas). Estos nombres no reflejan la diversidad de las funciones biológicas en las que participan.
Una breve descripción de estos factores y sus principales funciones, facilitan una noción de su actividad pleiotrópica:
PDGF se identificó a principios de los 70s. Es un dímero formado por dos cadenas. Hasta ahora se habían identificado tres isoformas AA, BB, AB; que se unen a dos tipos específicos de receptores alfa y beta; la unión a receptores alfa tiene efectos quimiotácticos, y la unión a receptores beta efectos en la proliferación celular. Las plaquetas proporcionan el suministro inicial y el más abundante de PDGF. Es un mitógeno potente para fibroblastos, células endoteliales y musculares (15) Modula las actividades de otros factores de crecimiento. Recientemente se han identificado la cadena C y D y se estudia su presencia en las plaquetas así como sus funciones (16)
TGF-beta se identificó en el año 83 por su capacidad de estimular la proliferación celular mediante un mecanismo que es independiente de la adhesión. Pertenece a una familia de proteínas, que incluye las BMPS, con actividades diversas. TGF-beta1 es abundante en las plaquetas se libera en el inicio de la reparación. Su ausencia en el lugar de la lesión retrasa la reparación, como se ha comprobado con ratones “knock-out” para esta proteína. Este factor es especialmente pleiotrópico, su actividad depende de numerosos factores como concentración, presencia de otros factores de crecimiento, fenotipo celular etc. (17, 18)
IGF-I, la mayoría de los FCs son sintetizados por el megacariocito, sin embargo IGF-1 y la proteína que modula su actividad biológica, IGFBP-3 (insulin growth factor binding protein-3) (19), se sintetizan en el hígado y desde ahí se liberan al torrente sanguíneo, donde son capturados por la plaqueta mediante un mecanismo de endocitosis, y posteriormente almacenados en los gránulos alfa.
HGF, se describió inicialmente en 1992, como mitógeno para los hepatocitos. Se trata de una proteína multifuncional presente en los gránulos alfa plaquetarios.
Tres de los FCs presentes en el PRGF, se caracterizan principalmente por su participación activa en la angiogénesis.
Estos son VEGF, bFGF y EGF
VEGF se aisló en los años 70 y se identificó como mediador en la permeabilidad vascular. En la actualidad se conocen cinco isoformas distintas con distintos pesos moleculares. Actúa en receptores tirosina cinasa situados en las células endoteliales. Proporciona un estimulo angiogénico potente y prolongado, su efecto es sinérgico con bFGF (15)
FGF: la familia de FCs ligados a heparina incluye 9 proteínas, de FGF1 a FGF9. FGF2, presente en plaquetas, contribuye a la angiogénesis en el tejido granulado estimulando la infiltración y proliferación de células endoteliales (15)
EGF se descubrió inicialmente en las glándulas salivares en 1962, fue el primer factor de crecimiento que se identificó; estimula la epitelización y también actúa en fibroblastos y células musculares lisas. La presencia de EGF, junto con TGF-beta y HGH explica los efectos curativos de la saliva, y que sea éste uno de los recursos, que utilizan los animales para lograr la cicatrización de las heridas. (20)
Además de estos factores de crecimiento la preparación de PRGF contiene fibrinógeno que se transforma en un coágulo de fibrina, tras la adición, al plasma, de cloruro de calcio. La red tridimensional de fibrina asociada con fibronectina y vitronectina proporciona una matriz provisional que actúa como soporte de las células infiltradas, éstas incluyen neutrófilos, monocitos, fibroblastos, células progenitoras y células endoteliales (21)
Esta red de fibrina no es inerte, y en ella se inician los mecanismos de la reparación. Las células infiltradas utilizan receptores de membrana tipo integrina que reconocen dominios específicos en la fibrina, vitronectina y fibronectina, interaccionando a través de ellos con dicha red tridimensional. Este hecho tiene mucha importancia porque estas interacciones de integrinas de la membrana celular con la red de fibrina influyen en la activación celular (22) Como consecuencia de estas interacciones, derivan señales de expresión génica que controlan la expresión de proteínas integrantes de la matriz extracelular ó bien enzimas que la degradan como la colagenasa MMP-1, y además pueden modular la respuesta de las células a las distintas señales proteicas (23)
La malla de fibrina facilita la adhesión celular y la proliferación y no produce inflamación; además su estructura tridimensional facilita la angiogénesis en su interior así como la deposición de matriz extracelular; dicha fibrina se reabsorbe una vez que ha servido como molde para la regeneración.

Preparación del PRGF.
Se realiza una extracción de sangre al paciente mediante punción venosa, unos minutos antes de comenzar la cirugía y de la administración de la anestesia. El volumen de sangre que se extrae se adaptará a cada caso clínico concreto, como se describe a continuación. La sangre se recoge en tubos que contienen citrato sódico al 3,8% como anticoagulante. El plasma se separa mediante centrifugación a 450 g (1800 rpm) durante ocho minutos (PRGF System III, BTI, Vitoria) El volumen de plasma por tubo de 4,5 mL que se obtiene tras la centrifugación será de unos 2 mL, cuando el hematocrito esté dentro de los parámetros clínicos habituales. Como resultado de esta centrifugación se consigue un gradiente en la concentración de plaquetas.
La fracción plasmática de 0,5 mL situada inmediatamente por encima de la serie roja y la serie blanca es lo que denominamos PRGF (Figura 1) Se trata de una fracción de plasma con un alto contenido en plaquetas, unas tres veces el número de plaquetas presentes en sangre periférica; dichas plaquetas se caracterizan además por su mayor densidad comparando con las plaquetas de las otras fracciones y por esta razón durante el centrifugado se sitúan más abajo; esta mayor densidad se debe a que son plaquetas jóvenes, que llevan pocos días en el torrente sanguíneo y no han sufrido ningún desgaste ni activación parcial (24) La concentración de FCs en estas plaquetas es significativamente superior al resto de las plaquetas de las otras fracciones plasmáticas. Por esta razón este plasma es especialmente rico en FCs.
Para activar las plaquetas y coagular el fibrinógeno se añaden 50 uL de cloruro cálcico por cada mL de plasma. Como resultado de la adición de cloruro de calcio, el plasma inicia un proceso dinámico de coagulación, que finaliza con la retracción del coágulo. En ese coágulo de fibrina recién formado están contenidos los FCs plaquetarios (Figura 1) Se puede controlar dicho proceso y formar el coágulo “in vitro” para su posterior aplicación ó bien “in situ” aplicando el plasma recién activado todavía en fase líquida para que coagule en el mismo lugar de la lesión.

Aplicación del PRGF en lesiones tendinosas.

Debido a su limitado aporte sanguíneo y al escaso recambio fisiológico de sus células, la regeneración de una rotura tendinosa es un proceso lento, que en ausencia de un tratamiento quirúrgico, puede ser incompleto.
Las investigaciones en la biología de la reparación tendinosa proporcionan un conocimiento básico de los procesos por los cuales el tendón se repara, así como evidencias experimentales sobre el papel de los FCs en las distintas fases. Los factores de crecimiento, cuyas actividades han sido mejor caracterizadas, en la reparación y remodelado de tendón y ligamento, son: IGF-I, TGF-beta, VEGF, PDGF y bFGF. Estos cinco factores están en concentraciones elevadas tras la lesión tendinosa y son activos en el transcurso de la reparación (25) La aplicación de PRGF suministra los citados FCs, son las señales proteicas necesarias para que se inicie la fase de proliferación, reduciendo así la duración de la fase inflamatoria y acortando significativamente el tiempo total de reparación (26).

Tratamiento quirúrgico de una rotura tendinosa.
Es conveniente reiterar que la utilización del PRGF no debe cambiar la técnica quirúrgica habitual; pero dado que la asociación de PRGF con la cirugía, tiene como efecto fundamental una reducción de la duración e intensidad de la fase inicial inflamatoria y una aceleración de la fase de proliferación, se coordinarán las fases de recuperación funcional con el desarrollo de los citados mecanismos biológicos. Por lo tanto, se acortará el tiempo de inmovilización y se acelerarán las diferentes fases de la fisioterapia. De esta forma se obtendrá un tejido de reparación de mejor calidad, en un tiempo claramente más corto.

Procedimiento: Se realiza la extracción de sangre 20-30 minutos antes de la cirugía; el volumen de extracción adaptará a cada caso concreto, siendo 40 cc para tendones grandes como el tendón de Aquiles. Se instala al paciente, en función del tendón lesionado, y se aborda la lesión utilizando la técnica quirúrgica habitual. En nuestra práctica habitual, los tendones de gran tamaño como el Aquiles ó el rotuliano se suturan con cintas de PDS. Para otros tendones, como el manguito de los rotadores, se utilizan suturas trenzadas de gran resistencia. Después de suturar el tendón, se inyecta entre las fibras tendinosas, aproximadamente 4 cc de PRGF recién activado (sin coagular), como se ha descrito anteriormente. A continuación se coloca, alrededor de la sutura, una lámina coagulada de PRGF. Por último se irriga el tejido subcutáneo con la última fracción de PRGF, recién activado, que coagulará in situ, durante el cierre subcutáneo. Sea cual sea el tendón suturado, se repite la misma secuencia de aplicación del PRGF, adaptando el volumen de plasma a las dimensiones del tendón.

Tratamiento quirúrgico de una tendinosis degenerativa.
Tras abordar la lesión, se extirpan las zonas degeneradas y necróticas del tendón y se practican las escarificaciones según la técnica habitual. Como se ha explicado anteriormente, se realiza la extracción de sangre al paciente, unos minutos antes de la cirugía, en el mismo bloque quirúrgico; a continuación se prepara el PRGF.
Seguidamente, se rellenan, con coágulos de PRGF, los defectos generados como consecuencia de la extirpación del tendón degenerado. Asimismo, se aplican pequeños coágulos de PRGF en las zonas escarificadas del tendón. A continuación, se recubre la lesión con una lámina coagulada de PRGF y se cierra el subcutáneo irrigándolo con la última fracción de PRGF.

Tratamiento conservador de una tendinosis degenerativa.
Basándonos en los resultados obtenidos con PRGF, tanto en el tratamiento quirúrgico de roturas tendinosas, como en el tratamiento con infiltración percutánea de roturas musculares, se ha iniciado un estudio para valorar los beneficios de la infiltración de PRGF, en el foco de degeneración del tendón.
En primer lugar, se localiza el foco de tendinosis bajo control ecográfico y a continuación se “aviva” el foco; con este fin, se utilizan ondas de choque extracorpóreas, previa administración de anestésico local; como alternativa se pueden realizar escarificaciones percutáneas del foco de tendinosis con una aguja EV. Se inyectan bajo control ecográfico, dos fracciones de PRGF recién activado. Un nuevo control ecográfico, realizado una semana después, junto con el análisis de la sintomatología, establecen las pautas para una nueva aplicación. En general se realizan 2-3 aplicaciones de PRGF.
Es fundamental, desde el principio, acompañar la aplicación local de PRGF con un tratamiento de fisioterapia, dada la importancia de los estímulos mecánicos para inducir la orientación de las fibras y la regeneración.

Aplicación del PRGF en las lesiones musculares.

El tejido muscular tiene una gran capacidad de adaptación a demandas fisiológicas como crecimiento, entrenamiento ó a las lesiones musculares. En la respuesta del tejido muscular a estas situaciones participa una pequeña población de células, asociadas a la periferia de las fibras musculares, llamadas células satélite. Estas células, en condiciones normales, están en estado quiescente pero se activan en respuesta a ciertos estímulos, como el miotrauma (27)
La lesión muscular tiene como consecuencia, en una primera fase, la degeneración de las miofibras que se necrosan, por la acción de las proteínas de lisis que se liberan durante la lesión. El hematoma se forma rápidamente y contribuye a la degeneración del tejido, se produce la respuesta inflamatoria típica con infiltración de neutrófilos y otros leucocitos.
El tratamiento con PRGF implica la sustitución del coágulo inicial, por el PRGF activado con calcio. Las plaquetas liberan los FCs en el mismo lugar de la lesión; la presencia de FCs se asocia con la activación de las células satélite, que por acción de los FCs proliferan y expresan marcadores específicos miogénicos, llegado a este punto a estas células se les denomina mioblastos.
Éstos se fusionan y originan miotubos que evolucionan a fibras musculares promoviendo así la regeneración del músculo. Estudios recientes sugieren que IGF-I, HGF, bFGF, EGF, VEGF, TGF-beta y PDGF regulan la proliferación y diferenciación de células satélite y mioblastos, por lo tanto tienen un papel directo en la reparación y regeneración muscular (28,29).

Tratamiento con PRGF.
Se solicita un estudio RMN o ecográfico para definir exactamente la localización y el tamaño de la lesión muscular, así como la presencia o no de hematoma intramuscular. Se realiza la extracción de sangre al paciente, 20-40 cc de sangre, dependiendo de la magnitud de la lesión. Una vez centrifugada la sangre, se separa el PRGF; de cada tubo de sangre (de 5 cc), se utilizan las dos fracciones más ricas del PRGF. Se infiltran 4-8 cc de PRGF adaptando el volumen al tamaño de la lesión. Se realiza un nuevo control ecográfico para localizar el hematoma del que se evacua el máximo posible. Sin retirar la aguja, se inyecta en el foco de la lesión, PRGF recién activado con el cloruro cálcico. Se recomienda al paciente la aplicación de hielo local durante unos minutos.
Al cabo de una semana se realiza otro control ecográfico. En caso de persistir un hematoma residual o un seroma se procede de nuevo a su evacuación y la aplicación de una nueva dosis de PRGF, como se ha descrito anteriormente. El número de aplicaciones variará en función del tamaño de la lesión y de la sintomatología dolorosa que produzca. Habitualmente las roturas pequeñas presentan una evolución favorable con una sola aplicación de PRGF. Las roturas medianas o grandes pueden precisar dos o tres aplicaciones de PRGF con la frecuencia de una semanal. En ninguno de nuestros pacientes hemos debido administrar más de tres aplicaciones.
En cuanto la sintomatología dolorosa lo permita se iniciará un tratamiento asociado de fisioterapia, ya que está bien demostrado que el estímulo mecánico favorece en gran medida la regeneración muscular. Esta fisioterapia incluye electroestimulación muscular suave, electroterapia analgésica y antiinflamatoria y contracciones musculares isométricas, suaves al inicio del tratamiento, aumentando la intensidad a continuación y asociando estiramientos y contracciones isotónicas en función de la evolución.


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